抗菌肽的研究及其运用

2012.11.23

　　抗菌肽又称抗微生物肽( antimicrobial peptide)或肽抗生素(peptide antibiotics)，在动植物体内分布广泛，是天然免疫防御系统的一部分。抗菌肽和常规的抗生素不同，它是某个特定基因编码的蛋白产物，因此具有独特的抗菌机制。

　　抗菌肽是通过物理作用造成细胞膜的穿孔而达到广谱抗菌的效果，所以不容易产生抗性菌作用和交叉抗性反应;另一方面，在改造合成抗菌肽基因以及动物的转抗菌肽基因工程等方面，抗菌肽潜在的价值也已经受到人们广泛关注。

　　1 抗菌肽的理化性质、分子结构及其分类

　　抗菌肽是一种小分子多肽，天然的抗菌肽通常由30多个氨基酸残基组成，碱性，含有4个或4个以上带正电荷的氨基酸。某些抗菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有强有力的杀伤作用。天然抗菌肽通常是由30多个氨基酸残基(AA)组成的碱性小分子多肽，含有4个或多于4个带正电荷的氨基酸，如赖氨酸(Lys)或精氨酸(Arg)，N端亲水，C端疏水。水溶性好，分子量约为4 KD。大部分抗菌肽具有热稳定性，在100 ℃时加热10～15 min仍能保持其活性;等电点大于7，对较大的离子强度和较高或较低的pH值，均具有较强的抗性。此外部分抗菌肽具备抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力。

　　抗菌肽广谱抗菌，单一一种肽可抑杀多种细菌、真菌，还可杀死某些寄生虫，对多种癌细胞及动物实体瘤有明显的杀伤作用，甚至对含包膜的病毒都能起作用;另外，还能加速免疫和伤口愈合过程，抗菌肽的作用对象虽种类繁多，但有一点是相同的，都含有膜成分。抗菌肽发挥防御作用的基础在于微生物细胞膜结构的特点，这些特点是动植物所不具备的，这方面的研究使人们对抗菌肽的认识更深入，也促使人们创造新的抗感染疗法。抗菌肽种类繁多，到目前为止已经有500多种抗菌肽被分离和鉴定，仅从昆虫体内分离获得的就多达170余种。

　　虽然抗菌肽分子量较小，多为13～45个AA残基组成的短肽，但AA序列、肽链长度及高级结构各不相同，按照抗菌肽的结构特征，可以分为以下四类：①阳离子型抗菌肽，是抗菌肽种类最多的一类，到目前为止，已经从不同物种中发现400多种阳离子型抗菌肽，其中一半来源于昆虫，并得到有效分离。阳离子型抗菌肽按结构不同又分为3 类：线性且含有α2螺旋结构的抗菌肽;包括一个或几个二硫键的富含半胱氨酸的抗菌肽;富含某种AA 如Pro、Gly 或His 的抗菌肽。②阴离子型抗菌肽，是在哺乳动物上皮细胞中发现的一类新型抗菌肽。③芳香族二肽。④来源于氧结合蛋白的多肽，抗菌肽作用机制与传统抗生素有很大不同。目前，关于抗菌肽的作用机制主要有以下几种：①离子通道的形成;②抑制细胞呼吸;③抑制细胞外膜蛋白的合成;④抑制细胞壁的形成。

　　2 抗菌肽的抗菌机理

　　关于抗菌肽的作用机理，不同的学者提出了不同的看法。目前研究得最为清楚的是膜渗透机理，认为抗菌肽是利用自身的结构特点，在细菌细胞膜上形成电势依赖性通道，改变细胞膜的通透性，造成细胞内容物外泄而死亡。具体过程是抗菌肽分子通过其两亲性α-螺旋上的正电荷与细菌细胞质膜磷脂分子上的负电荷之间的静电吸引而结合在质膜上，紧接着抗菌肽分子中的疏水端插入到质膜中，之后α-螺旋也插入到质膜中，这样就打乱了质膜上蛋白质和脂质原有的排列秩序，使细菌失去了膜势，不能保持正常的渗透压而死亡。有关的电生理实验表明，抗菌肽在细菌细胞膜上形成的离子性通道是依赖时间和电压的，通道的持续开放时间为2.5 ms，通道直径为4 nm。但是Cazil等依据其通过衰减全反射傅立叶变换红外光谱和分子动态模拟等手段得出的实验结果，对此提出了不同的见解。他们认为，抗菌肽只是结合到了单位膜的表面上，并未见到抗菌肽插入膜中，更未形成通道，这使通道机制遇到了挑战。但无论如何，抗菌肽的作用靶部位是细菌细胞质膜，以及它的作用结果是导致细菌细胞质膜通透性增大等基本内容是确切无疑的，这也正是抗菌肽与传统抗生素对细菌作用机制不同的本质所在。抗菌肽通过物理方式和质膜发生作用，这可能是抗菌肽最主要的抗菌机理。但随着研究的深入，人们发现抗菌肽还可以以其他的方式产生抗菌效果，但不同的抗菌肽，其杀菌方式各有差异，可能其杀菌效果的发挥是通过多种因素的协同作用。研究发现某些抗菌肽可以通过抑制细胞的呼吸作用来杀菌，某些富含脯氨酸的抗菌肽和细菌的热休克蛋白结合而发挥抗菌活性。

　　3 抗菌肽的应用研究

　　抗菌肽为开发新的抗生素开辟了广阔的前景，极有可能成为无毒或低毒副作用的抗肿瘤新药，有广阔的应用前景.

　　3.1 在畜牧业上的应用借鉴已成功的昆虫抗菌肽转基因工程，如转基因蚊子，在植物方面还有转基因马铃薯等，把特异的抗菌肽基因转入畜禽特定细胞，让其表达，从而产生出抗病新品种。有报道，柞蚕抗菌肽用于预防及治疗鸡的白痢效果明显。应用含抗菌肽的柞蚕免疫血淋巴粉添加于断奶仔猪料中，饲喂试验结果表明，蚕抗菌肽可减轻断奶仔猪的腹泻。

　　根据马卫明等的报道，猪小肠抗菌肽对鸡大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、猪致病性沙门氏菌、绿脓杆菌、鱼致病性嗜水气单胞菌等细菌均有不同程度的抑制作用，杀菌率59.5%～98.5%不等。扫描电镜下观察猪小肠抗菌肽作用后细菌形态学的改变，结果发现，有的细菌表面出现囊泡样或不规则突起样结构;有的细菌严重变形、扭曲，一端呈火柴头状;有的细菌表面变得粗糙、皱缩、胞膜破裂、内容物外流而死亡。

　　3.2 抗菌肽在基因工程上的应用抗菌肽分子量较小，对多种动植物病原菌具有广谱的抗性作用，同时对动植物细胞无毒副作用，因此抗菌肽动植物基因工程的研究能广泛开展起来，期望将抗菌肽的基因转入动植物体内并得到表达，达到抗病的目的。Lee等构建猪PR239转基因小鼠，并成功获得该基因的表达，显著提高小鼠对链球菌感染的抵抗力。抗菌肽转基因植物方面的研究在模式植物烟草及马铃薯的研究较为成功，贾士荣等将不同的抗菌肽基因转入马铃薯中，获得的这些基因的马铃薯青枯病发病延迟，病情指数低下，植株死亡率降低。此外，在其他农作物如菊花、毛白杨、番茄等在转基因抗菌肽方面也做了一些工作，并取得很大进展。

　　3.3 抗菌肽作饲料添加剂应用的优势抗菌肽能耐受饲料制粒时的高温，规模化发酵生产时，经高温浓缩工序，可充分杀灭酵母菌体而不导致抗菌肽失活，产品在推广应用后不会出现工程菌的扩散而导致环境生态问题。抗菌肽杀菌机理独特，病原菌不易对抗菌肽产生耐药性。以工程菌工业化发酵生产抗菌肽，可大规模生产，周期短、成本低且不受季节和气候变化等外在因素的影响。此外，抗菌肽在食品工业上可被研制开发成有应用价值的新型食品添加剂。

　　3.4 抗菌肽的药用前景

　　3.4.1 柞蚕免疫血淋巴治疗乙型肝炎的效果滞育柞蚕蛹经接种灭活的大肠杆菌诱导产生免疫血淋巴，含有多种免疫成分如抗菌肽、抗菌蛋白、溶菌酶等;供治疗乙型肝炎的胶囊，试验证实其在合适剂量能显著或极显著降低鸭血清乙型肝炎病毒水平，能抑制鸭体内乙型肝炎病毒复制增殖作用。

　　3.4.2 抗菌肽在治疗癌症上的应用抗菌肽对体外培养的癌细胞有作用，主要是使癌细胞膜上形成孔洞，内容物外泄，线粒体出现空泡化，嵴脱落，核膜界限模糊不清，有的核膜破损，核染色体DNA断裂，并抑制染色体DNA的合成，细胞骨架也受到一定程度的损伤。昆虫抗菌肽具有广谱抗菌、抗病毒、抗癌能力，以及活性浓度低，无致畸变作用，无蓄积毒性，不易产生抗药性等优点，有望成为新一代的抗菌、抗病毒、抗癌药物。

　　3.4.3 局部感染治疗机体受感染后趋向于在局部区域产生抗菌肽，最早临床研究也是从局部感染治疗开始。目前，已进入临床实验阶段的抗菌肽有细菌素、源于蛙马盖宁的MSI - 78及源于猪Protegrin的IB - 367。用细菌素治疗奶牛乳头皮肤局部感染时，发现它在1 min内就可杀死金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克氏杆菌等病原菌，且无毒副作用。

　　3.4.4 系统感染治疗抗菌肽对系统感染也有疗效，人工合成的CAP - 18对绿脓杆菌引起的腹部感染有疗效，protegrin能抑杀对二甲氧基苯青霉素产生耐药性的金黄色葡萄球菌，及对万古霉素产生耐药性的肠道球菌和绿脓杆菌;indolicidin可抵御曲霉菌感染。

　　3.4.5 抗菌肽的抗寄生虫作用抗菌肽可有效杀灭使人类及动物共同发生寄生虫病的寄生虫，目前发现一种合成的天蚕素- 蜂毒素杂合体对莱什曼原鞭毛虫有损伤作用;Shahabuddin研究发现昆虫抗菌肽对感染蚊子的疟原虫发育的不同时期有不同的作用，主要对疟原虫的卵囊期和子孢子期造成明显的损伤。

　　4 问题与展望

　　4.1 要将抗菌肽应用到临床治疗，还有许多问题有待于解决 ①由于抗菌肽的分子量比大部分抗生素大，生产成本高，目前还无法投入大规模生产。②表达系统载体和动物源的抗菌肽来源十分有限，不能满足研究和临床应用的需要;化学合成和基因工程成为获得抗菌肽的主要手段，但成本较高，通过基因工程方法对抗菌肽进行表达，而大部分抗菌肽对表达载体都有抗杀作用，一般都选择酵母菌，或者使抗菌肽以融合蛋白的形式表达，这样又增加了后加工的难度。③人类对抗菌肽的毒性了解少，主要根据天然抗菌肽在人体内的浓度来推测人体对其忍受的程度，其危险性、稳定性等有待解决。④抗菌肽在体内容易被蛋白酶水解，影响基因的高水平表达，因此需用脂质包涵体或对其进行化学修饰来保护等。⑤小分子物质的分离、纯化比较困难，这也是限制其生产成本的主要因素。⑥抗菌肽一级结构和作用时的空间分子结构与生物活性的关系还需要进一步研究。⑦通过基因工程在微生物中直接表达抗菌肽基因，目前还存在技术上的困难，即可能造成宿主微生物自杀而不能获得产物;虽可以以融合蛋白的形式表达抗菌肽，但也存在产物少的问题。⑧抗菌肽的稳定性和免疫反应问题，这就要对抗菌肽进行分子改造，使之既能抵抗蛋白酶的分解，又不会在人体内产生强烈的抗原性，也是目前国际上的一个研究热点，抗菌肽分子结构与功能的研究，目前还处于研究初始阶段，真正阐明了抗菌肽结构和功能的关系后，人们就可以有的放矢地合成新的抗菌肽，为更多的抗菌肽进入临床和其他用途提供机会。

　　4.2 前景展望近年来，对抗菌肽的研究越来越重视，不仅在分子水平上研究抗菌肽在动物免疫防御系统中精细的合成过程及其调控机制，而且探讨其药用开发价值，努力使之成为继青霉素等传统抗生素之后的又一类重要的新型抗菌药物，抗菌肽结构与功能关系的研究为设计新的多肽类抗生素提供了理论依据，也为研究生物分子结构和功能的关系提供了绝好的模型，随着基因工程的进展和生化技术的提高，抗菌肽在医药、农业和科研等领域将有着广阔的前景。而且一些重要的抗菌肽的基因正陆续被克隆，转基因研究已成为抗菌肽研究的热点领域，如抗菌肽转基因水稻、番茄等的成功，极大地提高了植物的抗病能力。可以相信，人们通过转抗菌肽基因将获得更多的抗病动植物新品种;把特异的抗菌肽基因转入畜禽特定细胞让其表达，从而产生抗病新品种，也不失为一条发展畜牧生产的新途径。

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